高分辨率熔解HRM的運(yùn)作原理和市場(chǎng)前景

高分辨率熔解(High-resolutionmelting，簡(jiǎn)稱HRM)分析是一門新興的技術(shù)。它僅僅通過(guò)PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測(cè)PCR片段的微小序列差異，從而應(yīng)用在突變掃描、序列配對(duì)和基因分型等多個(gè)方面。憑借其速度和簡(jiǎn)便性，高分辨率熔解這種方法正在迅速普及。

其實(shí)雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀(jì)六十年代，當(dāng)時(shí)是通過(guò)紫外吸收來(lái)監(jiān)測(cè)的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0°C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個(gè)小時(shí)才能完成。后來(lái)，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細(xì)管而縮減至納克級(jí)，且熔解速率更快，達(dá)0.1-1.0°C/秒，這樣熔解時(shí)間縮短至幾分鐘。當(dāng)時(shí)使用的染料是SYBR®GreenI。

然而，這種熔解分析只能區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，比如檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴(kuò)增。如果要區(qū)分SNP，分辨率還不夠。為什么呢?這里有必要先介紹一下飽和染料和非飽和染料。SYBRGreenI就屬于非飽和性染料，由于它對(duì)PCR的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度很低，遠(yuǎn)未將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒(méi)有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降。

于是，飽和染料問(wèn)世了。為什么稱為飽和染料呢?因?yàn)樗鼈兗幢阍陲柡蜐舛?熒光最大)下，也不會(huì)抑制PCR。故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過(guò)程中就不會(huì)發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場(chǎng)上的飽和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、SYTO9等幾種。光有染料還不夠，儀器也要相應(yīng)升級(jí)呢。

擴(kuò)增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個(gè)堿基發(fā)生了突變，都會(huì)改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個(gè)差異極小，只有零點(diǎn)幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無(wú)法檢測(cè)的。

那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢?根據(jù)儀器現(xiàn)有的功能測(cè)試，在熔解操作時(shí)每攝氏度至少要獲得10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，這是對(duì)儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導(dǎo)致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無(wú)法保證HRM分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。大多數(shù)常規(guī)定量PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5°C，這也決定了它們無(wú)法勝任HRM。

目前市場(chǎng)上有多個(gè)廠家提供HRM分析的儀器，包括IdahoTechnology、Corbett(QIAGEN)、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。HRM的發(fā)明者—美國(guó)猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Wittwer實(shí)驗(yàn)室曾評(píng)估了市場(chǎng)上多臺(tái)儀器在基因分型和突變掃描上的性能1。他們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大部分儀器的準(zhǔn)確基因分型來(lái)說(shuō)，主要限制在于平板上的空間溫度差異(Tm的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.020-0.264°C)。其它差異如數(shù)據(jù)密度、信噪比和熔解速率，也會(huì)影響雜合體的掃描。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，空氣加熱型儀器以及樣品溫度單獨(dú)控制的儀器有著更低的Tm標(biāo)準(zhǔn)偏差(0.018-0.065)，而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。

在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析就可以開(kāi)始啦。這個(gè)過(guò)程其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是對(duì)PCR的擴(kuò)增子進(jìn)行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過(guò)程中，擴(kuò)增子逐漸解鏈，在到達(dá)熔解溫度(Tm)時(shí)，DNA鏈完全分開(kāi)。在HRM分析的初期，熒光強(qiáng)度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強(qiáng)度也就下降了。HRM儀器通過(guò)照相機(jī)，記錄下熒光變化的整個(gè)過(guò)程。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的作圖，就生成了熔解曲線。索取更詳細(xì)的技術(shù)資料渦街流量計(jì)

果然夠簡(jiǎn)單吧，連探針也無(wú)需設(shè)計(jì)，只要在常規(guī)PCR中加一個(gè)飽和染料即可。HRM既可以對(duì)未知突變進(jìn)行篩查、掃描，也可以對(duì)已知突變進(jìn)行分析。相對(duì)于傳統(tǒng)的突變分析而言，操作步驟大大簡(jiǎn)化，時(shí)間和成本也降低了不少。而且樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM分析，無(wú)需轉(zhuǎn)移，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)。

正是憑借這些優(yōu)勢(shì)，HRM近年來(lái)廣泛用于突變掃描、序列配對(duì)、基因分型和甲基化分析等應(yīng)用中。

序列配對(duì)

序列差異分析常用的方法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、測(cè)序等，這些方法都需要分離樣品，之后進(jìn)行多步反應(yīng)，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且PCR產(chǎn)物有污染的風(fēng)險(xiǎn)。而HMR在5分鐘之內(nèi)就能完成，無(wú)需額外的步驟，也容易開(kāi)發(fā)成高通量篩選，且是唯一的閉管操作，增加了分析的可靠性，這些優(yōu)勢(shì)對(duì)于分子診斷分析而言，格外重要。

在器官移植中，醫(yī)生通常會(huì)檢測(cè)兄弟姐妹的HLA，以便了解主要組織相容性是否匹配。利用PCR產(chǎn)物的熔解曲線，能快速配對(duì)HLA序列。與熔解溫度(Tm)不同，那只是熔解曲線上的一個(gè)點(diǎn)，高分辨率熔解是分析整個(gè)熔解曲線。利用熔解曲線的形狀作為指示劑，來(lái)顯示雜合DNA所形成的異源雙鏈的序列匹配。之后將兩個(gè)DNA按1：1的比例混合，重新熔解，并將新曲線與原先的曲線進(jìn)行比較，來(lái)驗(yàn)證序列的匹配。如果兩個(gè)樣品的序列不是完全相同的，那么混合后異源雙鏈的熔解曲線形狀會(huì)改變。

瑞典烏普薩拉大學(xué)的OlofGidlöf等曾開(kāi)發(fā)出線粒體基因組中兩個(gè)超變區(qū)HVI和HVII的HRM分析，以分辨不同個(gè)體的DNA，作為法醫(yī)鑒定中測(cè)序前的預(yù)篩選2。研究結(jié)果表明，線粒體DNA中HVI和HVII所存在的序列變異確實(shí)產(chǎn)生了熔解曲線形狀的差異，能辨別不同個(gè)體的DNA，這樣就能排除不匹配的法醫(yī)材料，從而節(jié)省線粒體DNA測(cè)序的時(shí)間和費(fèi)用。另外，與其它技術(shù)相比，HRM操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低，能同時(shí)篩選大量的樣本。

突變掃描

單堿基改變、插入、缺失都能通過(guò)HRM來(lái)檢測(cè)。在靈敏度和特異性方面，高分辨率熔解也高于dHPLC在內(nèi)的傳統(tǒng)方法。當(dāng)變異體為低等位基因片段時(shí)，它甚至比DNA測(cè)序還靈敏。測(cè)序只能檢測(cè)低至20%的變異體，而HRM能檢測(cè)的變異體低至2%。而且，測(cè)序所花的時(shí)間、費(fèi)用和精力，與HRM是不可同日而語(yǔ)的。

對(duì)于400bp以下的PCR產(chǎn)物，掃描單堿基變化的靈敏度和特異性皆為100%。對(duì)于400到1000bp的PCR產(chǎn)物，靈敏度為96.1%，特異性為99.4%。PCR產(chǎn)物中變異的位置不影響掃描準(zhǔn)確性。盡管HRM是為檢測(cè)雜合體(一個(gè)等位基因發(fā)生突變)而設(shè)計(jì)的，但它也能檢測(cè)純合體(兩個(gè)等位基因都有突變)。對(duì)于半合子變異體(X連鎖或Y染色體)，最好將未知樣品與已知野生型的樣品混合。

LMNA基因的突變會(huì)導(dǎo)致多種失調(diào)，現(xiàn)在稱之為核纖層蛋白綜合征。由于待研究的個(gè)體頗多，故必須用一種特別靈敏且特異的方法來(lái)進(jìn)行突變掃描。于是，GillesMillat等就開(kāi)發(fā)出適合LMNA突變掃描的HRM分析3。他們同時(shí)用了HRM和dHPLC兩種方法，對(duì)64位患有擴(kuò)張性心肌病的病人進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，凡是dHPLC或直接測(cè)序能檢測(cè)出的基因變異，HRM分析也能輕松鑒定，且速度比dHPLC快2倍，還更為經(jīng)濟(jì)。研究人員認(rèn)為，HRM分析是鑒定LMNA遺傳變異的高靈敏、高通量的廉價(jià)方法。

基因分型

傳統(tǒng)的基因分型方法不僅耗時(shí)費(fèi)力，還需要購(gòu)買價(jià)格不菲的探針。相比之下，HRM分析則是優(yōu)勢(shì)多多，無(wú)需擴(kuò)增和制備，排除了污染的風(fēng)險(xiǎn);探針的錢也省了;還能檢測(cè)未知的變異體，這一點(diǎn)探針可無(wú)能為力。有了飽和染料，PCR產(chǎn)物全程被標(biāo)記，因此所有的熔解區(qū)域都能檢測(cè)到。對(duì)于同一擴(kuò)增子內(nèi)的不同雜合體，通過(guò)曲線形狀的差異也能區(qū)分開(kāi)。HRM大約能分辨93%的雜合體。大部分純合體也能通過(guò)熔解來(lái)分辨，但不是全部。大約有4%的人單堿基變異體有著相同的Tm，且圖像對(duì)稱。在這種情況下，可以將已知的純合體與未知的純合體混合，再進(jìn)行分析。

LasseKristensen等曾為參與甲基代謝的關(guān)鍵基因(MTHFR、MTR和DNMT3b)開(kāi)發(fā)出HRM分析，對(duì)它們進(jìn)行基因分型，并在Rotor-gene6000等儀器上進(jìn)行檢測(cè)4。他們認(rèn)為，與基于TaqMan探針的基因分型相比，HRM分析更經(jīng)濟(jì)。無(wú)需使用探針，分析所需的優(yōu)化也更少，成功率更高。與焦磷酸測(cè)序、SNP芯片等多種技術(shù)相比，HRM是最佳選擇。

甲基化分析

HRM分析還為DNA甲基化狀態(tài)的檢測(cè)另辟蹊徑。DNA樣品通過(guò)亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例。

異常的甲基化模式往往與癌癥相關(guān)聯(lián)，于是ErciSmith等開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了快速定量DNA甲基化狀態(tài)的HRM分析5。他們利用數(shù)學(xué)方法來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化加熱DNA所產(chǎn)生的原始熒光數(shù)據(jù)，從這些數(shù)據(jù)中計(jì)算出熔解開(kāi)始和結(jié)束的溫度，從而反映模板分子的甲基化水平。之后，他們還用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA進(jìn)行了驗(yàn)證。他們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)HRM分析這種快速單管的方法來(lái)定量甲基化是可靠的，引物容易設(shè)計(jì)，且無(wú)需專門的軟件。所獲得的參數(shù)提供了標(biāo)本中甲基化的客觀描述和定量，能用于標(biāo)本之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

綜上，HRM技術(shù)應(yīng)用廣泛，操作簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)，結(jié)果精確且可靠，適合任何實(shí)驗(yàn)室使用。市場(chǎng)上有一些專供HRM分析的儀器，不過(guò)，那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實(shí)用。QIAGEN的Rotor-GeneQ(CorbettRotor-Gene6000)就是全球第一臺(tái)將實(shí)時(shí)擴(kuò)增與HRM分析技術(shù)相結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光定量分析裝置。Rotor-GeneQ的溫度均一性為0.01°C，溫度分辨率為0.02°C，解決了溫度均一性、精確性和分辨率的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了定量擴(kuò)增與HRM的合二為一。